Forschung für den Mittelstand - Die IGF-Projektdatenbank

Zentrifugalmikrofluidische Automatisierung der Probenvorbereitung für die proteomische Analyse von infektionsbiologisch relevantem Kohortenmaterial durch Massenspektrometrie

Die biologische Massenspektrometrie entwickelt sich zunehmend zum Standardwerkzeug der Laboratoriumsmedizin. Vermehrt durchgeführt werden sogenannte Massenspektrometrie basierte Kohortenscreenings, deren Ziel es ist, eine hohe Genauigkeit und statistische Signifikanz für klinische Biomarker zu erreichen. Allerdings stehen in vielen hierfür durchgeführten klinischen Studien nur geringste Probenmengen (5-20µl) von Körperflüssigkeiten zur Verfügung, die vornehmlich manuell für massenspektrometrische Analysen aufbereitet werden. Bis heute gibt es keine nennenswerte Robotertechnik, die in der Lage ist Probenmengen dieser Größenordnung stabil und im Hochdurchsatz zu bearbeiten. Die Folge davon ist, dass die Probenvorbereitung fehleranfällig (CV >10%) und aufwendig von Hand durchgeführt werden muss. Dieser Mangel im Stand der Technik soll in diesem Vorhaben adressiert werden und es ermöglichen, Biomarker in Körperflüssigkeiten, welche oft geringe Mengenänderungen aufweisen (<1.5fach) mit hoher Sensitivität und Spezifität zu detektieren.

Entwickelt wird eine automatisierte, präzise und reproduzierbare (Volumen CV <3%) Handhabung kleinster Probenmengen (<1µl) von Körperflüssigkeiten. Mittels zentrifugaler Mikrofluidik wird der enzymatische Verdau von Proteinen zu einem Peptidgemisch sowie dessen Aufreinigung (Peptidintensität CV <3%) automatisiert. Entwickelt werden sollen Einwegchips, die mit einer Standardlaborzentrifuge betrieben werden können. Ziel ist es die bisher manuell durchgeführte Probenvorbereitung (Kosten: ca. 60-80€ pro Probe) für die nachgeschaltete nano-LC-MS/MS kostengünstiger (Ziel: 3€ pro Probe) unter Steigerung der Reproduzierbarkeit zu ersetzen.

Das beantragte Forschungsvorhaben „NanoPrep“ ist besonders relevant für KMUs, die Massenspektrometrie für die Proteomik als Dienstleistung anbieten. Für KMU sind aufgrund der kleineren Probenzahl selbst bei größeren Probenmengen die hohen Investitionskosten für eine Automatisierung oft nicht wirtschaftlich.

Ergebniszusammenfassung:

Im Zentrum dieses Vorhabens stand die Machbarkeit einer zentrifugalmikrofluidisch automatisierten Probenvorbereitung von biologischem Kohortenmaterial für die proteomische Massenspektrometrie nachzuweisen. Die prinzipielle Vorgehensweise war den hierfür gängigsten Probenvorbereitungsassay auszuwählen, diesen an die Rahmenbedingungen der zentrifugalen Mikrofluidik anzupassen und dann zu automatisieren. Dieser Probenvorbereitungsassay besteht aus folgenden zwei Schritten:

1) Verdau: Die Proteine einer Probe (z.B. Serum) werden mittels des Enzyms Trypsin zu Peptiden verdaut. Der Verdau wird durch eine Ansäuerung mittels Essigsäure nach einem definierten Zeitraum abgestoppt.

2) Entsalzen: Anschließend wird der Peptidmix aufgereinigt d.h. Elemente (wie z.B. Salze), die die massenspektrometrische Analyse stören würden, werden entfernt. Dies geschieht mittels Festphase d.h. die Peptide binden z.B. an einer Säule an, anschließend werden die störenden Bestandteile weggewaschen und schließlich die Peptide eluiert.

Für beide Schritte konnten im Rahmen von NanoPrep eine Automatisierung mittels zentrifugaler Mikrofluidik demonstriert werden. Beim Verdau konnte hierbei - bei einer gleichen Anzahl von identifizierten Proteinen - eine höhere Reproduzierbarkeit nachgewiesen werden. Bei der Entsalzung wurde die gleiche Anzahl von Proteinen identifiziert. Hinzu kommen die allgemeinen Vorteile einer Automatisierung (u.a. Reduzierung der Fehler durch signifikant weniger Schritte, die ein Benutzer durchführen muss, Ersparnis von Arbeitszeit, Standardisierung).

Zudem konnte ein automatisiertes Interfacing zum LC-MS/MS mittels Autosampler gezeigt werden.