Forschung für den Mittelstand - Die IGF-Projektdatenbank

Identifizierung und Nachweis von Amylasen zur Sicherung der Qualität von stärkehaltigen Milcherzeugnissen

Die steigende Nachfrage nach ungekühlt länger haltbaren Milcherzeugnissen führte in den letzten Jahren zur erhöhten Produktion von stärkehaltigen und hitzebehandelten Milcherzeugnissen (z. B. Joghurterzeugnissen, UHT-Desserts). Trotz guter Hygienepraxis werden bei diesen Milchprodukten vermehrt Probleme bei der Haltbarkeit beobachtet, die sich in der partiellen oder vollständigen Verflüssigung des Produkts durch Abbau der als Stabilisatoren/Verdickungsmittel zugesetzten modifizierten Stärke durch Amylasen äußern. Die Veränderungen treten unvermittelt, z.T. erst nach Monaten, auf und bedingen für die Hersteller kostenspielige Produktrücknahmen. Prinzipiell könnten diese Amylasen direkt, als Rückstände technischer Prozesse oder über die produzierenden Mikroorganismen in Rohwaren und Produkte eingetragen werden.

Ziel des Vorhabens ist es zu klären, welche Amylasen hierfür verantwortlich sind, über welchen Weg diese in die Produkte bzw. Rohstoffe gelangen und wie Amylase-Rückstände effizient und sensitiv nachgewiesen werden können. Insbesondere ist vorgesehen, einen praxistauglichen Schnelltest zum Amylasenachweis zu entwickeln.

Die deutsche Milchindustrie gehört zu den wichtigsten Branchen der Lebensmittel-industrie und ist zunehmend exportorientiert. Der wirtschaftliche Schaden durch sich verflüssigende Produkte, die meist für den Exportmarkt bestimmt sind, kann insbesondere für KMU existenzbedrohend sein (hohe Rückrufkosten, Imageverlust). Verlässliche Analysenmethoden zum Nachweis der Amylasen werden deshalb die Wettbewerbsfähigkeit insbesondere dieser Unternehmensgruppe sichern.

Ergebniszusammenfassung:

Im Projekt konnten keine Hinweise darauf gefunden werden, dass das Wachstum von Stärke-abbauenden Keimen in den Produkten zu verflüssigten Fehlprodukten führt. Mittels proteomischen Ansatz konnte aber der Produktfehler auf eine Kontamination mit einer CGTase zurückgeführt werden. In Modellversuchen zeigte sich, dass CGTasen aber auch α-Amylasen selbst im Spurenbereich von < 1 ng/ml in der Lage sind, bei stärkehaltigen Milchprodukten eine Verflüssigung zu induzieren. Die relevanten Enzyme werden zudem unter UHT-Bedingungen nicht inaktiviert.

Durch verschiedene Maßnahmen konnten im Projekt zwar die Nachweisgrenzen kommerzieller Enzymtests um bis zu Faktor 30 verbessert werden, dies reicht aber nicht aus, um die Enzyme in Rohwaren auf dem erforderlichen Sensitivitätsniveau nachzuweisen. Daher wurde ein innovatives Nachweissystem entwickelt, das darauf beruht, dass der amylolytische Abbau von entsprechend designten Enzymsubstraten mittels Enzymimmuntest (EIA) nachgewiesen wird. Einfache Protokolle zur Synthese der für den Testaufbau benötigten Farbstoff-markierten Enzymsubstrate wurden etabliert, sowie hochaffine Farbstoff-spezifische Antikörper generiert. Auf Basis dieser Antikörper konnten anschließend Sandwich-EIAs etabliert werden. Nach Optimierung des Verfahrens, wobei für den enzymatischen Vorverdau wichtige Parameter sowie immunchemische EIA-Variablen im Fokus standen, konnten mit dem Testsystem amylolytische Enzyme, insbesondere α-Amylasen und CGTasen, ultrasensitiv im Bereich von 0,1 pkat/ml nachgewiesen werden. Die Anwendbarkeit wurde für Rohwaren und stärkehaltige Endprodukte wie Puddings und Fruchtjoghurts überprüft. Bei letzteren Proben traten allerdings aufgrund einer kompetitiven Hemmung durch die Stärke Probleme auf. Die anderen Untersuchungen zeigten aber, dass mit dem o. a. Ansatz ein effizientes, zuverlässiges und ultrasensitives Verfahren zum Nachweis von amylolytischen Enzymen in Rohwaren im Spurenbereich etabliert werden konnte.