Forschung für den Mittelstand - Die IGF-Projektdatenbank

Duplex-Amplifikationsverfahren zum in situ-Schnellnachweis hygienerelevanter Keime auf flexiblen Endoskopen

Ziel des beantragten Forschungsvorhabens ist ein in-situ-Schnellnachweis für hygienerelevante Keime auf inneren und äußeren Endoskopoberflächen entsprechend Anlage 10 der Leitlinie zur Validierung von Endoskopaufbereitungsverfahren. Der Nachweis einzelner hygienerelevanter Keime beruht auf der selektiven Markierung mit Aptameren aus DNA, die nach der Markierung durch thermische Denaturierung wieder quantitativ von den Keimen abgelöst und aus dem Endoskop eluiert werden können. Wiedergewonnene Aptamere werden durch Hybridisierung an komplementäre DNA-Abschnitte (Oligonukleotide) auf spezifischen Auswertefeldern zum Nachweis von S. aureus, Enterobacteriaceae, Pseudomonaden und Enterokokken in einer Auswerteeinheit gebunden. Der Nachweis der Aptamere erfolgt durch ein Duplex-Amplifikationsverfahren. Dabei binden zunächst sphärische DNA-Hybrid-Aggregate (SDHA) an die Aptamere, die zusätzlich zu den zur Bindung an Aptamere notwendigen Oligonukleotiden zahlreiche Initiator-Oligonukleotide tragen. In einem Folgeschritt werden in einer Hybridisierungskettenreaktion an den Initiator-Oligonukleotiden zahlreiche metastabile Carbon Quantum Dot funktionalisierte Oligonukleotide gebunden, so dass hochmolekulare fluoreszierende Produkte entstehen, die bei Anregung mit UV-Licht visuell ohne weitere Hilfsmittel ausgewertet werden können.

Den zunehmend mit der Aufbereitung von Medizinprodukten betrauten, mehr als 21.700 Reinigungs- und Hygienedienstleistern (vorwiegend KMU) und den von den mehr als 9.400 medizinischen Einrichtungen selbst betriebenen Aufbereitungseinheiten für Medizinprodukte wird ein innerbetrieblich und kostengünstig anwendbarer Schnellnachweis zur eigenständigen, innerbetrieblichen Prüfung der Aufbereitungsqualität flexibler Endoskope zur Verfügung gestellt; daraus ergeben sich wirtschaftliche Vorteile von >19 Mio. €/a. Durch den Schnellnachweis wird die Sicherheit bei der Instrumentenaufbereitung verbessert und das Risiko für Patienten reduziert.

Ergebniszusammenfassung:

Ziel des Forschungsvorhabens war ein in-situ-Schnellnachweis für hygienerelevante Keime auf inneren und äußeren Endoskopoberflächen entsprechend Anlage 10 der Leitlinie zur Validierung von Endoskopaufbereitungsverfahren. Der Nachweis einzelner hygienerelevanter Keime beruhte auf der selektiven Markierung mit Aptameren aus DNA, die nach der Markierung durch thermische Denaturierung wieder quantitativ von den Keimen abgelöst und aus dem Endoskop eluiert werden können. Mittels Durchflusszytometrie konnte ermittelt werden, dass sich unter Einsatz eines Aptamers gegen Enterococcus faecium bis zu 40 % der Zellen markieren ließen. Die thermische Ablösung gebundener Aptamere konnte bei 60 °C nachgewiesen werden.

Wiedergewonnene Aptamere konnten durch Hybridisierung an komplementäre DNA-Abschnitte (Oligonukleotide) auf spezifischen Auswertefeldern zum Nachweis einzelner mikrobieller Arten (z.B. S. aureus, Enterobacteriaceae, etc.) gebunden werden. Zum Nachweis der gebundenen Aptamere wurden sphärische DNA-Hybrid-Aggregate (SDHA) entwickelt, diese konnten unter Einsatz von Goldnanopartikeln mit einem Durchmesser von 20 nm oder unter Einsatz von carboxylierten Latex-Beads mit einem Durchmesser von 1 µm durch Bindung von Oligonukleotiden mit teilkomplementärer Sequenz zu den nachzuweisenden Aptameren hergestellt werden. Andere auf der Oberfläche der SDHA immobilisierte Oligonukleotide dienten als Initiatoren zur Auslösung einer hohen Anzahl (1. Amplifikation) von Hybridisierungskettenreaktionen (HCR). Den zunehmend mit der Aufbereitung von Medizinprodukten betrauten Reinigungs- und Hygienedienstleistern und den von den medizinischen Einrichtungen selbst betriebenen Aufbereitungseinheiten für Medizinprodukte wird durch das Duplex-Amplifikationsverfahren ein innerbetrieblich und kostengünstig anwendbarer Schnellnachweis zur eigenständigen, innerbetrieblichen Prüfung der Aufbereitungsqualität flexibler Endoskope zur Verfügung gestellt.