Forschung für den Mittelstand - Die IGF-Projektdatenbank

Fluoreszenzquantifizierung bakterieller Endosporen mittels Aptazympaaren und Molecular Beacons

Ziel des beantragten Forschungsvorhabens ist ein Verfahren zur simultanen Quantifizierung von Endosporen (Gesamtsporenzahl) und Endosporen hygienerelevanter Bakterien (z.B. C. difficile, B. cereus): Dies lässt sich durch Entwicklung von Aptazympaaren und speziell als Nukleozymsubstrate designten Molecular Beacons realisieren, wobei die Aptazyme eines Paares das gleiche Substrat spalten. Das erste Aptazym eines Paares wird bei Bindung eines primären Zielmoleküls (Konzentration proportional zur Sporenzahl) aktiviert und spaltet das Molecular Beacon, wobei ein Fluorophor und ein Quencher freigesetzt werden. Der freigesetzte Quencher dient als induziertes Zielmolekül für das zweite Aptazym. Somit verdoppelt sich die Anzahl induzierter Zielmoleküle bei jeder Substratspaltung, was mit zunehmender Inkubationszeit zum exponentiellen Anstieg der Anzahl induzierter Zielmoleküle und freigesetzter Fluorophore führt (exponentielle Signalzunahme).

Den über 22.000 Reinigungsdienstleistern und den 2.300 textilen Dienstleistern (beide vorwiegend KMU) wird durch die Projektergebnisse ein Verfahren zur Verfügung stehen, das sie erstmals befähigt, die Sporenbelastung von Oberflächen, Textilien und Prozesswässern im Rahmen innerbetrieblicher Eigenkontrollen zu bewerten und somit den Erfolg von ihnen vorgenommener Dekontaminationsmaßnahmen zu überwachen. Beim Nachweis von Endosporen (z.B. C. difficile, B. cereus) können umgehend für die Sporendekontamination geeignete Maßnahmen ergriffen und die Hygienesicherheit weiter optimiert werden. Lässt sich der Umsatz externer Reinigungsdienstleister im Sektor Krankenhausreinigung bei Einsatz des Verfahrens zur Fluoreszenzquantifizierung von Endosporen (z.B. C. difficile) um nur 5 % steigern, resultiert ein wirtschaftlicher Vorteil von über 9 Mio. €/a. Ferner ergibt sich bei Anwendung des Verfahrens zur Fluoreszenzquantifizierung von Endosporen des Bakteriums B. cereus ein wirtschaftlicher Vorteil von über 15 Mio. €/a für textile Dienstleister.

Ergebniszusammenfassung:

Einige bakterielle Erreger können widerstandsfähige Endosporen ausbilden, die sich bei routinemäßigen Reinigungs-/Desinfektionsmaßnahmen unter Einsatz bakterizid wirkender Desinfektionsmittel und -verfahren nicht mit ausreichender Sicherheit beseitigen lassen und bis zu mehreren Monaten auf Oberflächen oder Textilien überdauern können. Ziel des Forschungsvorhabens war daher, ein eigenständig und ohne Fachkenntnisse durchführbares Verfahren zur Fluoreszenzquantifizierung von Endosporen hygienerelevanter Bakterien (C. difficile, B. cereus) zu realisieren. Ein solches Verfahren würde Reinigungsdienstleister erstmals befähigen, die Sporenbelastung von Oberflächen, Textilien und Prozesswässern im Rahmen innerbetrieblicher Eigenkontrollen eigenständig zu bewerten und somit den Erfolg von ihnen vorgenommener Dekontaminationsmaßnahmen zu überwachen.

Im Fokus der Forschungsarbeiten standen aus DNA bestehende Moleküle, die in Gegenwart von Sporen zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals fähig sind: Zum einen wurden sog. Aptamere identifiziert, die an spezifische Zielmoleküle, z. B. auf der Sporenoberfläche hygienerelevanter Bakterien, binden. Zum anderen wurden DNAzyme identifiziert, die über eine katalytische Aktivität verfügen. Für die DNAzyme wurde fluorogene Substrate designt: Dabei handelte es sich um spezifische DNA-Stränge, die eine Stammschleifenstruktur ausbilden, in der der an dem einen Strangende gebundene Fluorophor und der an dem anderen Ende gebundene Quencher in unmittelbarer Nähe zueinander vorliegen. Solche Moleküle werden als Molecular Beacons bezeichnet.