Forschung für den Mittelstand - Die IGF-Projektdatenbank

Konvergenz-Amplifikation und Fluoroswitch-Detektion zum Nachweis hygienerelevanter ESKAPE-Erreger

Ziel ist ein kultivierungsunabhängiger Nachweis für die simultane Detektion aller sechs nosokomialen ESKAPE-Erreger (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp.) zur Kontrolle des Hygienestatus von desinfizierten Oberflächen in medizinischen Einrichtungen. Der simultane Nachweis einzelner Zellen beruht auf einer isothermalen Konvergenz-Amplifikation spezifischer DNA-Zielsequenzen, die ein einheitliches Amplifikationsprodukt (Amplikon) als Summenparameter erzeugt. Der Nachweis des Amplikons erfolgt durch einen immobilisierten Fluoroswitch, bei dem das Amplikon an eine komplementäre DNA bindet, die auf der Oberfläche von Goldnanopartikeln immobilisiert ist und am freien Ende ein Quantum Dot trägt. Dessen Fluoreszenz wird aufgrund der konformationsbedingten Nähe zwischen Quantum Dot und Goldpartikel unterbunden (switch off). Bei Bindung des Amplikons wird die erzwungene Konformation der DNA aufgehoben; diese streckt sich, und das Quantum Dot zeigt aufgrund des vergrößerten Abstandes zur Goldoberfläche eine starke Fluoreszenz (switch on). Der Fluoroswitch ist regenerierbar und kann für zahlreiche Nachweisreaktionen eingesetzt werden. Der Nachweis ermöglicht die Detektion einzelner Zellen der ESKAPE-Erreger innerhalb von 45 Minuten.

Den zunehmend mit der Flächendesinfektion in medizinischen Einrichtungen betrauten 22.400 Reinigungs- und Hygienedienstleistern (vorwiegend KMU) wird ein innerbetrieblich und kostengünstig anwendbarer Schnellnachweis zur eigenständigen Kontrolle des Hygienestatus von desinfizierten Oberflächen zur Verfügung gestellt, woraus sich wirtschaftliche Vorteile von ca. 41,9 Mio. €/a ergeben. Durch den Nachweis wird die Hygiene in den mehr als 163.000 medizinischen Einrichtungen, die nach § 23 Infektionsschutzgesetz (IfSG) eine Flächendesinfektion durchführen müssen, verbessert und das Risiko nosokomialer Infektionen reduziert.

Ergebniszusammenfassung:

Den zunehmend mit der Flächendesinfektion in medizinischen Einrichtungen betrauten Reinigungs- und Hygienedienstleistern sollte ein günstiger und innerbetrieblich anwendbarer Schnellnachweis zur Kontrolle des Hygienestatus von desinfizierten Oberflächen zur Verfügung gestellt werden. Das Ziel war daher ein kultivierungsunabhängiger Nachweis für die simultane Detektion aller sechs nosokomialen ESKAPE-Erreger (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp.). Der simultane Nachweis einzelner Zellen beruht auf der isothermalen Konvergenz-Amplifikation spezifischer DNA-Zielsequenzen, die ein einheitliches Produkt (Amplikon) als Summenparameter erzeugt. Dessen Nachweis erfolgt durch einen immobilisierten Fluoroswitch, bei dem das Amplikon die Konformation des Fluoroswitch derart verändert, dass er von der gequenchten (switch off) zu einer fluoreszierenden Konformation schaltet (switch on). Während der Projektbearbeitung konnten geeignete Zielsequenzen in der 16S rDNA identifiziert und die Konvergenz-Amplifikation erfolgreich entwickelt werden. Durch die Verknüpfung aller Amplifikationsschritte in einer einzigen Reaktion gelang der Nachweis von Zielsequenzkonzentrationen von ≥2 nM und ermöglichte die Amplifikation von einzelsträngigen Zielsequenzen sowie von kurzen doppelsträngigen PCR-Produkten. Die Differenzierung von DNA lebender und inaktivierter ESKAPE-Erreger durch Behandlung mit Propidiummonoazid (PMA) wurde erfolgreich demonstriert. Der spezifische Nachweis überlebender ESKAPE-Erreger mittels PMA-Behandlung konnte für 5 gängige Flächendesinfektionsmittel demonstriert werden. Die Forschungsergebnisse zeigen die prinzipielle Realisierbarkeit eines Schnellnachweises hygienerelevanter ESKAPE-Erreger auf Basis der Konvergenz-Amplifikation mit nachgeschalteter Fluoroswitch-Detektion.