Forschung für den Mittelstand - Die IGF-Projektdatenbank

Entwicklung eines sensitiven Nachweises von hitzestabilen Peptidasen in Milch

Hitzestabile Peptidasen von psychrophilen Mikroorganismen, die während der Kühllagerung von Rohmilch gebildet werden, können die weitere Prozessierung von Milch aktiv überstehen und später für unerwünschte Veränderungen durch Proteinhydrolyse in den Endprodukten verantwortlich sein. Insbesondere bei Milchprodukten mit langer Haltbarkeit/Lagerung (z.B. UHT-Milch) können hitzestabile Peptidasen (Endopeptidasen) Probleme, wie Koagulation oder Bitterkeit, hervorrufen, selbst wenn sie nur in sehr geringen Mengen vorkommen Solch niedrige Endopeptidaseaktivitäten sind derzeit mit kommerziell erhältlichen Enzymaktivitätstests nicht quantifizierbar.

Ziel des Vorhabens ist es, aufbauend auf den Ergebnissen des IGF-Projekts AiF 16588 N eine sensitive und spezifische analytische Methode für den quantitativen Nachweis hitzestabiler Endopeptidasen in Milch zu entwickeln. Die Ansatzpunkte für die Entwicklung dieser neuen Nachweismethode liegen in der Substratspezifität der hitzestabilen Peptidasen (Aktivitätsnachweis mit synthetischen Oligopeptiden) und in ihrer Sequenzhomologie (antikörberbasierter Nachweis bestimmter Peptidasesequenzen).

Eine frühzeitige Erkennung des noch Vorhandenseins aktiver Endopeptidasen beugt wirtschaftlichen Verlusten vor. Damit hat das Vorhaben eine hohe wirtschaftliche Relevanz für milchverarbeitende Betriebe.

Zusätzlich werden sich mit den "neuen" ELISA-Tests und den Substraten für Untersuchungslabors und Testentwicklern neue Geschäftsfelder eröffnen.

Der potentielle Nutzerkreis erstreckt sich über die Milch- und milchverarbeitende Industrie. Durch die Reduzierung von Qualitätsrisiken kann die Stellung der KMU auch international gestärkt werden. Volkswirtschaftlich betrachtet können Ressourcen wie Milch und Milchprodukte durch den Einsatz einer sensitiven Nachweismethode von hitzestabilen Peptidasen geschont und effizienter genutzt werden.

Ergebniszusammenfassung:

Ziel des Projekts war die Entwicklung eines sensitiven Nachweises für hitzestabile Endopeptidasen in Milch. Dafür wurden Endopeptidasen von Pseudomonas sp. (PE) anhand ihrer Sequenzhomologie und der Hitzestabilität (25 – 40 % Restaktivität nach UHT-Erhitzung) ausgewählt und produziert. Um den Einfluss von Milchproteinen auf das Nachweisverfahren zu reduzieren und die PE-Aktivität zu konzentrieren, wurde eine zweistufige Aufarbeitung für Milch entwickelt. Die Milch wurde zunächst angesäuert und erhitzt (95 °C, 1 min) und dann durch hydrophobe Interaktionschromatographie (Wiederfindung 43 %) konzentriert (10fach).

Die untersuchten PE wiesen eine breite Substratselektivität mit einer Präferenz für hydrophile, basische Aminosäuren (R, K, Q) an der P1-Position und unpolare, aliphatische Aminosäuren (V, L, D) an der P1‘-Position auf. Anhand der Substratselektivität und Sequenzhomologie untereinander wurden die PE in Gruppen unterteilt. Basierend darauf wurden chromogene/fluorogene Substrate für den PE-Nachweis ausgewählt, jedoch wurde keine Sensitivitätssteigerung gegenüber dem bisher verwendeten Na-Caseinat/OPA-Assay erreicht.

Daher wurde ein indirekter ELISA mit polyklonalen Antikörpern gegen die PE entwickelt. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen lagen bei 21 bzw. 26 ng/mL. Die Antikörper interagierten mit den PE abhängig von der Homologie und detektierten auch Endopeptidasen von Serratia sp. Endopeptidasen weiterer Milchkontaminanten oder milchendogene Peptidasen wurden nicht detektiert. Ein indirekter Sandwich-ELISA, welcher die Sensitivität steigern sollte, war aufgrund der Kreuzreaktivität der verwendeten Antikörper nicht realisierbar. Ein entwickelter indirekter, kompetitiver ELISA kann bei geringen Antigenkonzentrationen falsch-positive Ergebnisse des indirekten ELISA ausschließen.

Die „kritische“ PE-Aktivität, die bei 20 °C innerhalb von 3 – 6 Monaten zu Produktveränderungen führte, war 0,1 pkat/mL, was mit den entwickelten Methoden nicht detektierbar war.